内参基因筛选的必要性

内源性对照基因（Endogenous Control gene）又称内参基因（Reference gene），是基因表达实验的重要组成部分。使用内参基因来均一化目的基因表达变化，是目前解决样本处理和上样差异引起的潜在偏倚的最准确方法。

内参基因必须在所有供试样品中稳定表达，即内参基因在不同的组织或细胞来源、不同的处理、不同的时间点或其他试验条件之间不应改变其表达水平。

因为内参基因和目的基因处在相同的样本制备步骤中，内参基因的准确定量可以均一化不同样本间存在的以下几种差异：

（i）不同量的起始材料（Variation in the amount of starting material）

（ii）起始材料的质量（RNA/DNA quality）

（iii）RNA提取和cDNA合成的差异（RNA preparation &Reverse transcription efficiency）

尽管在规定的实验条件下稳定表达的任何基因都可以作为内参基因，但研究者们最常选择的几类内参包括：组成型表达的管家基因，例如细胞骨架蛋白 （ACTB）或核糖体RNA（18S rRNA）；或者参与基本细胞功能的基因，例如糖酵解途径相关基因（ GAPDH、PGK1）和蛋白质折叠相关基因（例如 PPIA）。目前几个常见内参基因，包括 18S rRNA、ACTB、和 GAPDH 已被广泛用于均一化表达差异，但通常未经实验验证。

然而，大量研究表明，这些基因在不同组织和不同实验条件下表现出不同的表达水平，需要谨慎使用[1]。Suzuki等人[2]统计了某年在高影响力期刊上， 90% 以上的 RNA 转录分析仅使用一个参考基因，最常用的基因是 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)、β-肌动蛋白 (ACTB) 以及 18S 和 28S rRNA。然而，一些研究指出，即 β-肌动蛋白和 GAPDH差异很大，因此不适合作为 RNA 转录分析的参考[3]。同时，也有报道称，对于某些实验来说18S的丰度过高，使用 GAPDH 可能优于使用 18S[4]。

下图中，我们测试了10个候选内参基因在6个不同处理样品中的表达情况，观察到了大部分候选内参在不同处理组样品间存在明显的表达差异。测试数据表明，即使采用“常见”的内参基因，也应考虑其表达稳定性。避免因试验处理带来内参表达变化，从而导致误差。

Figure 1. Expression of 10 candidate endogenous control genes in 6 samples with different treatments. Using 18S as control, the expression of 10 common candidate reference genes was studied, and the expression differences between different treatment samples were observed. It is suggested that even if we use “common” endogenous control, the expression stability should also be considered.

针对这种情况，最好的做法是评估几个候选基因，因为每个实验的理想对照将取决于许多变量，包括所涉及的细胞或组织类型以及待测试的条件范围。编码基本细胞功能所需的蛋白质的某些管家基因通常在一系列细胞类型和条件（包括疾病状态）中以组成型水平表达。虽然这些管家基因可以是内源性对照的良好候选物，并且值得考虑，但是一些经典管家基因（如β-肌动蛋白（β-Actin）和甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH））的表达在组织类型之间变化很大。在基因表达研究中使用管家基因作为内源性对照之前，必须检测管家基因表达的变异性。

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参考文献：

[1]Radonic A, Thulke S, Mackay IM et al. (2004) Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun  

[2]T Suzuki, P.J Higgins, D.R Crawford (2000)Control selection for RNA quantitation. Biotechniques 

[3]S Selvey, E.W Thompson, K Matthaei, R.A Lea, M.G Irving(2001)

Beta-actin—an unsuitable internal control for RT-PCR. Mol. Cell Probes,  

[4]K Gorzelniak, J Janke, S Engeli, A.M Sharma(2001),

Validation of endogenous controls for gene expression studies in human adipocytes and preadipocytes. Horm. Metab.

内参基因的选择列表如下：

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